2023年10月7日，國家藥品監督管理局發(fā)布《關(guān)于公開(kāi)征求《人源干細胞產(chǎn)品非臨床研究技術(shù)指導原則（征求意見(jiàn)稿）》意見(jiàn)的通知》，指導原則明確在非臨床研究中需要考慮以下因素（包括但不限于）：細胞來(lái)源、生物學(xué)特性、作用機制；生產(chǎn)過(guò)程（如體外培養、 純化、誘導分化、擴增、基因修飾/改造等）；終產(chǎn)品中不同分化階段細胞的數量/比例；終產(chǎn)品中可能殘留的非目的細胞（如未分化細胞、非預期分化細胞等）、非細胞成分（如雜質(zhì)/外源因子等）；臨床擬用人群、給藥方式、預期的藥理作用靶部位；細胞在受者體內的遷移、定植、分化及存續能力；細胞的免疫原性和受者對細胞的免疫反應；成瘤性和致瘤性的風(fēng)險等。對于指導原則中明確的考慮因素，盡早布局相關(guān)檢測。
分子檢測
基因表達分析：通過(guò)檢測細胞中特定的基因是否被激活或沉默，可以判斷細胞的類(lèi)型和狀態(tài)。例如，人胚干細胞和誘導多能干細胞通常表達一些多能性基因，如OCT4, SOX2, NANOG等，而人的成體干細胞則不表達或表達很低。基因表達分析的方法有很多，如實(shí)時(shí)熒光定量PCR（real-time quantitative PCR, RT-qPCR）、微陣列（microarray）、轉錄組測序（transcriptome sequencing）等。
蛋白質(zhì)檢測：通過(guò)檢測細胞表面或內部的特定的蛋白質(zhì)，可以判斷細胞的類(lèi)型和狀態(tài)。例如，人胚干細胞和誘導多能干細胞通常表達一些多能性標志物，如SSEA-3, SSEA-4, TRA-1-60, TRA-1-81等，而人的成體干細胞則不表達或表達很低。蛋白質(zhì)檢測的方法有很多，如免疫熒光染色（immunofluorescence staining）、流式細胞術(shù)（flow cytometry）、免疫印跡法（immunoblotting）等。
表觀(guān)遺傳分析：通過(guò)檢測細胞中DNA或組蛋白的甲基化、乙酰化等修飾，可以判斷細胞的類(lèi)型和狀態(tài)。例如，人胚干細胞和誘導多能干細胞通常具有一種稱(chēng)為雙向啟動(dòng)子（bivalent promoter）的表觀(guān)遺傳特征，即同時(shí)存在著(zhù)激活和沉默基因的修飾，使得它們可以在適當的信號下快速分化為不同的細胞類(lèi)型。而人的成體干細胞則沒(méi)有這種特征。表觀(guān)遺傳分析的方法有很多，如甲基化敏感性限制酶消化法（methylation-sensitive restriction enzyme digestion）、雙鏈DNA免疫沉淀法（double-stranded DNA immunoprecipitation）、染色質(zhì)免疫沉淀法（chromatin immunoprecipitation）等。
基本因素檢測
細胞來(lái)源：細胞來(lái)源是指干細胞產(chǎn)品中的細胞是從哪里獲取的，例如胚胎、臍帶血、骨髓、脂肪等。細胞來(lái)源可以通過(guò)一些標志物來(lái)鑒定，例如表面抗原、轉錄因子、基因表達等。一些常用的檢測方法有流式細胞術(shù)、免疫熒光、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。
生物學(xué)特性：生物學(xué)特性是指干細胞產(chǎn)品中的細胞具有的一些功能和性能，例如自我更新能力、增殖能力、分化能力、免疫原性等。生物學(xué)特性可以通過(guò)一些實(shí)驗來(lái)評估，例如集落形成實(shí)驗、細胞周期分析、分化誘導實(shí)驗、混合淋巴細胞反應等。
作用機制：作用機制是指干細胞產(chǎn)品在體內發(fā)揮治療作用的原理和途徑，例如遷移、定植、分化、分泌因子等。作用機制可以通過(guò)一些模型和技術(shù)來(lái)探究，例如動(dòng)物模型、熒光標記、基因芯片、蛋白質(zhì)組學(xué)等。
示例：干細胞來(lái)源檢測產(chǎn)品
-
采用一種基于引物探針的熒光報告系統，利用特異性的引物和探針來(lái)擴增和檢測不同來(lái)源的干細胞中的特征性基因或轉錄因子。例如，胚胎干細胞中的OCT4、NANOG、SOX2等，臍帶血干細胞中的CD34、CD133等，骨髓間充質(zhì)干細胞中的CD44、CD90等。
-
使用多重實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)，可以在同一反應管中同時(shí)檢測多個(gè)靶標，并使用不同顏色的熒光染料來(lái)區分。這樣可以提高檢測效率和準確性，同時(shí)節省試劑和樣品。
-
提供一套完整的反應體系和操作流程，包括模板提取、反應混合液配制、PCR反應條件設置、數據分析軟件等。用戶(hù)只需按照說(shuō)明書(shū)操作，即可獲得可靠的結果。
-
提供一系列的質(zhì)控品和標準品，用于驗證反應體系的性能和建立標準曲線(xiàn)。通過(guò)比較未知樣品的閾值循環(huán)數（CT值）和標準曲線(xiàn)，可以計算出未知樣品中干細胞的起始拷貝數和來(lái)源。
生產(chǎn)過(guò)程檢測
基于微流控芯片的干細胞培養和純化系統，可以實(shí)現高效、精確和可控的干細胞培養和分離。利用微流控技術(shù)，通過(guò)調節培養液的流速、溫度、氣體等參數，模擬干細胞的生理環(huán)境，促進(jìn)其增殖和分化。同時(shí)還可以利用微流控閥門(mén)和電泳技術(shù)，根據干細胞的大小、形狀、電荷等特性，實(shí)現干細胞的純化和收集。
基于核酸適配體的干細胞誘導分化，可以實(shí)現高效、簡(jiǎn)便和特異的干細胞誘導分化。利用核酸適配體技術(shù)，通過(guò)篩選出能夠特異性結合干細胞表面受體的核酸分子，模擬生長(cháng)因子或細胞因子的作用，激活干細胞的信號通路，誘導其向目標細胞類(lèi)型分化。目的要求具有低毒性、低免疫原性、低成本等優(yōu)點(diǎn)。
基于CRISPR/Cas9技術(shù)的干細胞基因編輯工具，可以實(shí)現高效、精確和靈活的干細胞基因修飾或改造。該工具利用CRISPR/Cas9技術(shù)，通過(guò)設計能夠特異性識別目標基因序列的導向RNA（gRNA），結合Cas9核酸酶，實(shí)現對干細胞基因組的切割或插入。該工具可以用于增加或減少干細胞的功能基因，或者引入外源基因，改變干細胞的表型或功能。
終產(chǎn)品檢測
基于熒光活細胞成像儀的干細胞分化分析系統，可以實(shí)現高通量、高分辨率和動(dòng)態(tài)的干細胞分化過(guò)程的監測和定量。該系統利用熒光活細胞成像儀，通過(guò)設置不同的波長(cháng)和濾鏡，對干細胞分化過(guò)程中表達的特異性熒光蛋白進(jìn)行連續拍攝和記錄。通過(guò)對圖像進(jìn)行分析，可以計算出不同分化階段細胞的數量、比例、形態(tài)、遷移等參數。該系統可以用于評估干細胞分化效率、穩定性和一致性。
基于流式細胞術(shù)的干細胞分化鑒定，可以實(shí)現快速、準確和特異的干細胞分化狀態(tài)的鑒定。利用流式細胞術(shù)，通過(guò)使用不同的熒光標記抗體，對干細胞分化過(guò)程中表達的特異性表面標志物進(jìn)行檢測和計數。通過(guò)對數據進(jìn)行分析，可以確定干細胞分化為哪些細胞類(lèi)型，以及各種細胞類(lèi)型的數量和比例。最終用于評估干細胞分化質(zhì)量、純度和多樣性。
基于單細胞轉錄組測序的干細胞分化譜系重建，實(shí)現高深度、高靈敏度和高分辨率的干細胞分化過(guò)程的解析和重建。利用單細胞轉錄組測序，通過(guò)對干細胞分化過(guò)程中每個(gè)單個(gè)細胞的全基因組表達水平進(jìn)行測定和比較。通過(guò)對數據進(jìn)行聚類(lèi)、降維、軌跡推斷等方法，揭示干細胞分化過(guò)程中的關(guān)鍵基因、信號通路、轉錄因子等因素，以及各種分化階段之間的關(guān)系和轉換。最終用于評估干細胞分化機制、潛能和多樣性。
非目的殘留檢測
干細胞終產(chǎn)品中可能殘留的非目的細胞和非細胞成分是影響干細胞產(chǎn)品安全性和有效性的重要因素，需要進(jìn)行嚴格的檢測和控制。
非目的細胞：非目的細胞是指干細胞產(chǎn)品中不符合預期目標的細胞，例如未分化細胞、非預期分化細胞等。這些細胞可能會(huì )導致受者體內發(fā)生不良反應，如免疫排斥、炎癥、腫瘤等。
細胞表面標志物檢測：利用特異性抗體或熒光染料，對干細胞產(chǎn)品中表達的特定細胞表面標志物進(jìn)行檢測，以區分不同類(lèi)型和狀態(tài)的細胞。例如，利用CD34、CD133等抗體，檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有未分化或部分分化的造血干細胞。一些常用的技術(shù)有流式細胞術(shù)、免疫熒光、酶聯(lián)免疫吸附試驗等。
基因表達檢測：利用特異性引物或探針，對干細胞產(chǎn)品中表達的特定基因或轉錄因子進(jìn)行檢測，以區分不同類(lèi)型和狀態(tài)的細胞。例如，利用OCT4、NANOG、SOX2等引物或探針，檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有未分化或部分分化的多能干細胞。一些常用的技術(shù)有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、原位雜交、基因芯片等。
非細胞成分：非細胞成分是指干細胞產(chǎn)品中除了目標細胞以外的其他成分，例如雜質(zhì)/外源因子等。這些成分可能會(huì )影響干細胞產(chǎn)品的質(zhì)量和穩定性，或者對受者體內造成污染或毒性。
內毒素檢測：內毒素是一種由革蘭氏陰性菌釋放的脂多糖，具有強烈的致炎和致死作用。內毒素可能會(huì )污染干細胞產(chǎn)品中使用的培養液、添加劑或器械等。
微生物檢測：微生物是指干細胞產(chǎn)品中可能存在的細菌、真菌、病毒等微小生物，可能會(huì )導致干細胞產(chǎn)品的污染或受者體內的感染。
免疫性原性
細胞的免疫原性和受者對細胞的免疫反應是影響干細胞產(chǎn)品安全性和有效性的重要因素，需要進(jìn)行嚴格的檢測和控制。一些常用的檢測方法有：
細胞的免疫原性：細胞的免疫原性是指干細胞產(chǎn)品中的細胞是否能夠被受者體內的免疫系統識別和攻擊，導致免疫排斥或耐受。細胞的免疫原性主要取決于細胞表面表達的主要組織相容性復合物（MHC）分子，以及其他共刺激分子、附屬分子等。細胞的免疫原性的檢測方法主要有：
MHC分型：利用特異性抗體或探針，對干細胞產(chǎn)品中表達的MHC分子進(jìn)行檢測，以確定其與受者體內MHC分子的相似度或差異度。一些常用的技術(shù)有流式細胞術(shù)、PCR-SSP、PCR-SSO等。
共刺激分子和附屬分子檢測：利用特異性抗體或探針，對干細胞產(chǎn)品中表達的共刺激分子和附屬分子進(jìn)行檢測，以評估其對受者體內T細胞活化或抑制的影響。一些常用的技術(shù)有流式細胞術(shù)、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。
受者對細胞的免疫反應：受者對細胞的免疫反應是指干細胞產(chǎn)品在受者體內引發(fā)的免疫應答，包括體液免疫和細胞免疫兩種類(lèi)型。受者對細胞的免疫反應主要取決于干細胞產(chǎn)品與受者體內MHC分子的匹配程度，以及其他因素如給藥方式、劑量、頻率等。受者對細胞的免疫反應的檢測方法主要有：
體液免疫檢測：利用特異性抗體或抗原，對受者血清中存在的針對干細胞產(chǎn)品中細胞或其成分的抗體進(jìn)行檢測，以評估其對干細胞產(chǎn)品在體內存活和功能的影響。一些常用的技術(shù)有酶聯(lián)免疫吸附試驗、熒光抗體試驗等。
細胞免疫檢測：利用特異性抗原或抗體，對受者外周血單個(gè)核細胞（PBMC）中存在的針對干細胞產(chǎn)品中細胞或其成分的T細胞進(jìn)行檢測，以評估其對干細胞產(chǎn)品在體內存活和功能的影響。一些常用的技術(shù)有混合淋巴細胞反應、ELISPOT、流式細胞術(shù)等。
成瘤性和致瘤性
成瘤性和致瘤性的風(fēng)險是指干細胞產(chǎn)品中的細胞是否能夠在受者體內形成腫瘤或誘發(fā)腫瘤，導致嚴重的不良后果。成瘤性和致瘤性的風(fēng)險主要取決于干細胞產(chǎn)品中的細胞類(lèi)型、分化狀態(tài)、基因穩定性、免疫相容性等因素。
細胞類(lèi)型和分化狀態(tài)檢測：利用特異性抗體或探針，對干細胞產(chǎn)品中表達的特定細胞類(lèi)型或分化狀態(tài)的標志物進(jìn)行檢測，以評估其是否具有成瘤或致瘤潛能。例如，利用OCT4、NANOG、SOX2等標志物，檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有未分化或部分分化的多能干細胞，這些細胞具有較高的成瘤性。利用p53、Rb、Bcl-2等標志物，檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有癌變或易癌變的細胞，這些細胞具有較高的致瘤性。一些常用的技術(shù)有流式細胞術(shù)、免疫熒光、實(shí)時(shí)熒光定量PCR等。
基因穩定性檢測：利用特異性引物或探針，對干細胞產(chǎn)品中存在的基因突變、缺失、重排等異常進(jìn)行檢測，以評估其是否影響細胞的正常功能或調控，導致成瘤或致瘤。例如，利用TP53、KRAS、EGFR等引物或探針，檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有與腫瘤相關(guān)的基因突變。利用FISH、CGH等技術(shù)，檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有與腫瘤相關(guān)的染色體異常。一些常用的技術(shù)有實(shí)時(shí)熒光定量PCR、FISH、CGH等。
免疫相容性檢測：利用特異性抗體或抗原，對干細胞產(chǎn)品中表達的主要組織相容性復合物（MHC）分子進(jìn)行檢測，以評估其與受者體內MHC分子的匹配程度，以及其對受者體內免疫系統的影響。例如，利用HLA-A、HLA-B、HLA-C等抗體，檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有與受者相同或相似的MHC I分子，這些分子可以減少免疫排斥反應，但也可能增加腫瘤逃逸反應。利用HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP等抗體，檢測干細胞產(chǎn)品中是否含有與受者不同或不相似的MHC II分子，這些分子可以增加免疫監視反應，但也可能增加免疫攻擊反應。一些常用的技術(shù)有流式細胞術(shù)、PCR-SSP、PCR-SSO等。
2023-10-16 |
